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ID 47684
フルテキストURL
タイトル(別表記)
Purification and Characterization of Thermostable Amidase from Thermus sp.O-3-1
著者
小林 史明
青峰 弘起
水無 渉 (株)三菱レイヨン
湯 不二夫
田村 隆 岡山大学
稲垣 賢二 岡山大学
抄録
The gene encoding a thermostable amidase (EC 3.5.1.4) from thermophilic bacterium Thermus sp.O-3-1, was cloned and expressed in Escherichia coli JM109. The cloned amidase gene (ami) is 930 bp and encodes a protein composed of 310 amino acids. The protein is predicted to have a molecular mass of 33,089 Da. The amidase from Thermus sp.O-3-1 was purified by heat treatment and DEAE Toyopearl 650M column chromatography. The molecular mass of the native enzyme was estimated to be about 70 kDa by gel filtration chromatography, indicating that the enzyme has a homodimeric structure. The purified enzyme was stable up to 80°C and within a pH range from 7.0 to 10.0. The optimum temperature and pH for enzyme activity were 90°C, and 9.0, respectively. The enzyme was strongly inhibited by the metal-chelating compound EDTA. The activity of the EDTA-treated enzyme was reactivated by the addition of Co(2+), Ni(2+) and Mn(2+) ions. Therefore the enzyme was predicted to be metalloenzyme. Finally, as a result of investigation into substrate specificity, the purified enzyme was suggested to be D-amino acid specific amidase, as it showed higher activity toward D-Leu-pNA than L-Leu-pNA.
抄録(別表記)
好熱性細菌Thermus sp.O-3-1 由来の耐熱性アミダーゼ遺伝子を大腸菌中にクローニングし,その塩基配列を決定した.ami 遺伝子は930 bp からなり,310アミノ酸をコードしていた.本酵素の分子量は33,089 Daであると予想された.Thermus sp.O-3-1 由来アミダーゼを大腸菌で生産させ,熱処理とDEAE-トヨパール650M陰イオン交換カラム等により精製した.ゲル濾過クロマトグラフィーとSDS-PAGE の結果から本酵素は分子質量33 kDa のサブユニット2分子からなるダイマー構造を有していることが明らかとなった.精製酵素の熱安定性は80℃まで,pH 安定性は7.0~10.0であり,安定性の 高い酵素であった.最適温度は90℃,最適 pH は9.0であ った.EDTA により活性が著しく阻害され,Co(2+)やNi(2+),Mn(2+)によって活性の回復,向上が見られたため,本酵素は金属酵素であることが示唆された.基質特異性の検討 の結果,L-Leu-pNA よりもD-Leu-pNA に対して高い活性を示したため,本酵素がD-アミノ酸基質に特異性を持つアミダーゼであることが判明した.本酵素は耐熱性を有するユニークなD-アミノ酸アミダーゼであり,今後産業利用が期待される.
キーワード
amidase
thermostable enzyme
Thermus
D-amino acid specific amidase
備考
原著論文 (Original paper)
発行日
2012-02-01
出版物タイトル
岡山大学農学部学術報告
出版物タイトル(別表記)
Scientific Reports of the Faculty of Agriculture Okayama University
101巻
出版者
岡山大学農学部
出版者(別表記)
Faculty of Agriculture, Okayama University
開始ページ
1
終了ページ
6
ISSN
2186-7755
資料タイプ
紀要論文
言語
Japanese
OAI-PMH Set
岡山大学
論文のバージョン
publisher
査読
無し
Sort Key
3
Eprints Journal Name
srfa