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ID 12355
Eprint ID
12355
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タイトル(別表記)
Purification, Characterization and Crystal Structure of Isoamylase from Thermophilic Bacteria Rhodothermus marinus
著者
立花 亜紀子 岡山大学
田村 隆 岡山大学
今田 勝巳 大阪大学
木下 実紀 大阪大学
難波 啓一 大阪大学
堤 紀子 ノボザイムズ ジャパン
橋田 みよ子 ノボザイムズ ジャパン
坂口 博脩 ノボザイムズ ジャパン
稲垣 賢二 岡山大学
抄録
The isoamylase gene from Rhodothermus marinus was cloned into and expressed in Escherichia coli Top 10. As a result of characterization of purified R. marinus isoamylase. the enzyme had an optimum pH of 4.0 and optimum temperature of 70℃. Thermal inactivation studies of the purified R. marinus isoamylase revealed the enzymatic activity to be uninfluenced after one hour incubation at 60℃. These results suggest that R. marinus isoamylase has high thermostability. The crystallization and crystal structure analysis of R. marinus isoamylase was performed. The three-dimensional structure at 1.9Å resolution was determined in complex with the panose. R. marinus isoamylase is composed of three domains N, A and C, and, has a (β/α)8-barrel in domain A. The secondary structural alignments of the R. marinus isoamylase and P. amyloderamosa isoamylase was carried out. They have the four active-site consensus regions characteristic of the α-amylase family. And the essential residue of the α-amylase family (D359, E395, and D467) was conserved in these enzymes. R. marinus isoamylase has shorter loops than P. amyloderamosa isoamylase. And R. marinus isoamylase had no Ca2+ binding site. These results are thought to be factors of thermostability of R. marinus isoamylase.
抄録(別表記)
Rhodothermus marinus 由来イソアミラーゼ遺伝子を組み込んだプラスミド pBX2を使用し,大腸菌 Top10株を形質転換し,16時間の前培養,24時間の本培養後,菌体破砕し,得られた無細胞抽出液を熱処理(80℃,10 min),50オ硫安分画,陰イオン交換カラムクロマトグラフィー(DEAEントヨパール),ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーに供して本酵素の精製を行った.本精製酵素の性質検討を行った結果,本酵素の最適反応温度は70℃,pH4であり,また本酵素は60℃で1時間処理しても活性が低下することが無く,Pseudomonas amyloderamosa 由来イソアミラーゼよりも高い耐熱性を有することが判明した.本酵素の結晶化・X線結晶構造解析を行った結果,本酵素は P. amyloderamosa 由来イソアミラーゼと同様Nドメイン・AドメインCドメインの3つのドメインから構成されており,活性残基(D359,E395,D467)など活性中心付近のアミノ酸残基も P. amyloderamosa 由来イソアミラーゼと同様,高度に保存されていた.本酵素の熱安定性が P. amyloderamosa 由来イソアミラーゼよりも高 い要因として,P. amyloderamosa 由来イソアミラーゼよりもループの長さが全体的に短いことと,カルシウムイオン結合サイトの欠如が挙げられた.今後さらに構造解析を進めることにより,本酵素の熱安定性機構,反応 機構など更なる知見が得られることが期待される.
キーワード
isoamylase
Rhodothermus marinus
crystal structure
thermostability
発行日
2008-02
出版物タイトル
岡山大学農学部学術報告
出版物タイトル(別表記)
Scientific Reports of the Faculty of Agriculture Okayama University
97巻
1号
出版者
岡山大学農学部
出版者(別表記)
Faculty of Agriculture, Okayama University
開始ページ
1
終了ページ
7
ISSN
0474-0254 
NCID
AN00033029
資料タイプ
紀要論文
言語
Japanese
論文のバージョン
publisher
査読
無し
Eprints Journal Name
srfa